<Original Articles>Cell Proliferation and Differentiation of Cultured Chondrocytes Isolated from Growth Plate Cartilage of Rat Rib

Abstract

The present study was undertaken to investigate the relationship among cell morphology, proliferation, and maturation of chondrocytes in primary cultures. Chondrocytes were isolated from the growth cartilages of the rat ribs and cultured for 6 days. In situ DNA cytofluorometry using an inverted epi-illumination cytofluorometer (Nikon P1-I) and 3H-thymidine autoradiography were carried out for the correlated analysis of cell morphology and proliferation. Cytoskeletal staining with fluorescent phalloidin and 35S-sulphate autoradiography were also performed. In addition, in situ hybridization to c-myc mRNA was carried out using DNA probe. According to the results obtained, the cultured chondrocytes were composed of mixed populations of large, polygonal cells and of small, round cells. The round cells showed a significantly higher 35S uptake than the polygonal cells. The cytoskeletal staining clearly revealed stress fibers in the cytoplasm of the polygonal cells, whereas only a fine filamentous structure was shown in the cytoplasm of the round cells. In situ DNA cytofluorometry clearly demonstrated that cell proliferative activity was high in the polygonal cells and low in the round cells. In addition, 3H-thymidine autoradiography with cumulative labeling method revealed that the polygonal cells were changing into the small, round cells. C myc mRNA signals were detected in the cytoplasm of over a half of the round cells, whereas no evidence of c-myc expression were found in the polygonal cells. From these results, it appears that as the shape of the cultured chondrocytes shifts from polygonal to round, the cell proliferative activity decreases in association with cell differentiation. It was also suggested that c-myc mRNA is amplified in the well differentiated round chondrocytes, and not in the proliferative polygonal cells.

従来の培養軟骨細胞を用いた研究から, 軟骨細胞の形態と分化機能発現の聞には, 関連性のあることが示されている. 著者らは, 成長軟骨細胞の培養系において細胞形態, 機能が明らかに異なっている2種類の細胞が存在することを見いだした. 本研究では, この培養系を用い, 軟骨細胞の形態・細胞増殖動態・分化機能発現の3者の関連性を総合的に把握することを目的とした. このための方法論として, 細胞形態別増殖動態解析には, in situ DNA 顕微蛍光測光法と3_H-サイミジンオートラジオグラフィーを行い, 分化機能の検索には35_S オートラジオグラフィーを用いた. また, FITC-ファロイジン染色法により, 軟骨細胞の形態と細胞骨格の関係についても調べた. 更に, 本研究では, 悪性腫瘍以外に, 胎生期の細胞や分化途上の細胞にも出現し, 細胞の分化・増殖に深く関係があると考えられている c-myc 遺伝子の発現の有無を, in situ DNA- mRNA hybridization 法を用いて検索した. 実験には, ラット肋軟骨から分離・培養した成長軟骨細胞を用いた. 培養開始4 - 6日目頃の成長軟骨細胞は, 大型多角形の扁平な胞体を持ち, 大きな核を有する細胞(以下, 多角形細胞と略す)と, 比較的小型で類円形ないし球状の胞体と小さな核を有する細胞(以下, 円形細胞と略す)の2種類の細胞から構成されていた. in situ DNA 顕微蛍光測光法による細胞増殖動態解析の結果, 多角形細胞は, 活発な増殖性を示す2倍体細胞と少数の4倍体から構成されているのに対し, 円形細胞は, ほとんど増殖活性を持たない2倍体細胞から構成されていることが判った. 3_H-サイミジンの30分標識の結果から, 多角形細胞の標準率は11%, 円形細胞の標識率は0. 5%であり, その標識率の経時的変化はほとんど認められなかった. 3_H-サイミジンの持続標識実験の結果から, 多角形細胞が円形細胞に形態的に変化することが示唆された. また, 35_S オートラジオグラフィーより, 多角形細胞は, 軟骨基質の産生能が低く, 他方, 円形細胞では, 基質産生が亢進していることがわかった. FITC-ファロイジン染色によるアクチンの細胞内分布パタンを, 両細胞で比較したところ, 多角形細胞ではストレスファイバーがよく発達しているのに対し, 円形細胞には, 分断された線維性構造のみが観察された. 以上の結果をまとめると, 培養軟骨細胞の形態・増殖・分化の3者の間には, たがいに密接な関連が有り, 多角形細胞から円形細胞への形態変化に伴って, 増殖活性が低下し, 分化機能が発現されることが判明した. 次に, c-myc 遺伝子の発現の有無を in situ hybridization 法を用いて検索したところ, 円形細胞の過半数に, c-myc mRNA のシグナルが検出された. このことから, 軟骨細胞では, 分化機能発現と関連して c-myc 遺伝子が発現される可能性が示唆された.