Virus-induced Gene Silencing in Apricot (Prunus armeniaca L.) and Japanese Apricot (P. mume Siebold & Zucc.) with the Apple Latent Spherical Virus Vector System

Abstract

Apple latent spherical virus (ALSV) vectors have been shown to effectively induce stable virus-induced gene silencing (VIGS) in a wide range of plant species, including rosaceous fruit tree species such as apple (Malus × domestica Borkh.), pear (Pyrus communis L.), and Japanese pear (P. pyrifolia Nakai). In this study, we attempted to develop a VIGS-based gene evaluation system for two Prunus fruit tree species, apricot and Japanese apricot, using ALSV vectors. A partial sequence of the P. armeniaca PHYTOENE DESATURASE (ParPDS) gene was cloned and ligated into the T-DNA region of a binary vector, pBICAL2, designed based on RNA2 of ALSV. The resultant pBICAL2-ParPDS was introduced into a disarmed Agrobacterium strain, EHA105. pBICAL1, a binary plasmid for the expression of ALSV RNA1 in plants, was also introduced into EHA105. Leaves of Nicotiana benthamiana were infected with pBICAL1/EHA105 and pBICAL2-ParPDS/EHA105 simultaneously to produce and amplify recombinant ALSV particles. The amplified ParPDS-ALSV in N. benthamiana was isolated and infected into the cotyledons of apricot and Japanese apricot seedlings by particle bombardment. Although our attempts to infect wild and recombinant ALSVs into Japanese apricot seedlings were unsuccessful, uniform discoloration of the upper leaves, a typical phenotype of PDS knock down, was observed several weeks after inoculation in apricot seedlings. We discuss the possible use of this VIGS-based gene evaluation system in Prunus.

リンゴ小球形潜在ウイルス(apple latent spherical virus; ALSV)ベクターは, リンゴ(Malus × domestica Bork.), セイヨウナシ(Pyrus communis L.)およびニホンナシ(P. pyrifolia Nakai)などのバラ科果樹を含む幅広い植物種に無病徴で感染し, 安定してウイルス誘導性ジーンサイレンシング(virus-induced gene silencing; VIGS)を誘導できることが報告されている. 本研究では, ALSV ベクターを用いた VIGS 法により, アンズおよびウメの 2 種のサクラ属果樹の遺伝子機能評価系の開発を試みた. アンズのフィトエン不飽和化酵素(PHYTOENE DESATURASE; PDS)遺伝子の部分配列をクローニングし, ALSV RNA2 をコードするバイナリーベクター pBICAL2 の T-DNA 領域に組み込んだ. このコンストラクトおよび ALSV RNA1 をコードするバイナリーベクター pBICAL1 をそれぞれアグロバクテリウムに導入した. これらのアグロバクテリウム系統を同時に Nicotiana benthamiana の葉に接種し, 組み換え ALSV を増幅した. 増幅した組み換え ALSV を抽出し, 遺伝子銃を用いてアンズおよびウメの子葉に接種した. 数週間後, アンズの上位葉では PDS のノックダウンによる白化が観察されたが, ウメでは ALSV ベクターの感染が確認できなかった. サクラ属果樹における VIGS を利用した遺伝子機能評価の有効性について議論した.