樹木花粉の超低温貯蔵に関する基礎的研究 (II)

Abstract

花粉の低温処理によって起る凍結障害について論じた。すなわち凍結障害には2つあり, 1つは機械的損傷が花粉の細胞質や壁構造におこり, 他の1つは正常な機能を低下させる生理的障害である。1. 機械的な傷害は凍結の結果, 細胞質が花粉壁から剥離する偽原形質分離が多く, 凍結の時間が長かったり, 花粉含水量が多い場合は, さらに進行して細胞質内部に空白な氷晶痕を残す。これらは経時的に進行する。さらに急激に液体窒素に直接ふれると花粉粒は嘴状に裂開する。これらの傷害パターンを分類整理した。この他に細胞液に溶け込んでいたガス体が遊離してできる気泡が花粉の中にみられる場合もあるが, これは花粉の生存にとってあまり有害ではない。2. 生理的障害は凍結限界温度に近い冷却処理, 凍結限界含水率に近い含水量の花粉の冷却処理の場合に発生し, 培養基上において, 澱粉合成能力が低下, 又は, 全く消失する。また花粉管の伸張もよくない。3. 花粉の凍結の様式に2種類ある。1つは細胞内凍結であり, 1つは細胞外凍結である。細胞内凍結にはさらに2様式がみられる。すなわちFlashing現象で細胞質が微小な氷結晶で瞬間的に凍結される。この現象は顕微鏡下で花粉粒が暗黒に観察されることから容易に判別できるが, このとき花粉粒の形状は新鮮花粉と大差ない。Flashingした花粉を一旦解凍し, さらに再凍結させると全く異なった凍結様式により細胞内凍結がおこる。巨大な氷結晶の生長をみることから顕微鏡下では透明な花粉として観察され, 細胞質の萎縮, 花粉外形の変化を伴なう。細胞内凍結 (Flashing) を解除すると, カラマツ, サザンカ花粉等では顕著な外形の変化をもたらせる。特にカラマツではB型の傷害像として観察される。Exine, Intineと細胞質の剥離が見られ, マツ型花粉でも発芽孔部分に空白帯ができる。この現象は凍結偽原形質分離の一つと考えられる。この傷害型と第2次の細胞内凍結によっておこった現象を綜合すると, 壁構造の変性, つまり細胞壁が氷を透過しない性質が失なわれたものと考えられる。また細胞質の凍結により内部圧力のバランスがくずれ, Flashing解凍後カラマツ花粉は球形を呈する。これらの傷害が進行すると細胞質内に氷晶痕ができる。これらの現象はすべての花粉に共通するものではなく, ヒマラヤスギの花粉ではこの条件下では観察できない。またライムギ死花粉で実験すると, Flashingするばかりでなく, 再凍結しても再びFlashingし, Pseudoplasmolysisはみられない。4. 細胞外凍結はカラマツ花粉でよく観察できる。-5°Cで植氷し一10°Cで凍結した結果, Mediumである水が氷晶をつくり, 凍結時間が長くなると, 前葉体細胞側が特異的に萎縮する (写真8)。この細胞外凍結は花粉の生存に重大な影響は与えず, 解凍しても外型に変るところはない。5. 以上の他長期間超低温に貯蔵した花粉のうち, Quercus grauca, Magnolia grandiflora, Larixなどの花粉に気泡の発生をみることがある。比較的高い含水率の花粉に発生するが生存力に変りはない。またCamellia sasanqua花粉では凍結によりLipid様物質の滲出をみる。

This paper deals with the pattern of freezing and injury when pollen was deep-frozen. Two kind of injury was observed when pollen was deep-frozen, that is mechanical injury and physiological one. 1. The following phenomena are considered mechanical injury. Psuedoplasmolysis (separation of cytoplasm from cell wall), prolongation of time to freeze, formation of icecrystal in the cytoplasm when high water content pollen is deep-frozen and crack formation when pollen was directly immersed in liquid nitrogen (--196℃). Sometimes air bubbles were formed in cytoplasm but it was not harmful to germination. 2. Physiological injury appears when pollen was deep-frozen at about limiting temperature for crystalization or treated at about limiting water content for crystalization. Physiologically injured pollen decreased the ability of starch formation on agar medium or lost its ability, and elongation of pollentube was not good. Two kind of patterns was observed when pollen was deep-frozen. One is intracellularfreezing, the other is cxtracellularfreezing. There are two stages in intracellularfreezing. 1. "Flashing". Formation of minute ice-crystal in cytoplasm in a moment as the temperature falls. In this stage the shape of pollen is the same as the normal one. 2. "Pseudoplasmolysis" and shrink of cytoplasm. Flashed pollen is frozen twice, large ice-crystal is formed in the cytoplasm and it shrinks. Therefore the shape of pollen is changed completely. In the case of Larix, flashed normal (ellipsoidal) pollen turned to globose after thawing, and the membrane such as exine and intine separated from cytoplasm owing to pseudoplasmolysis. "Flashing" was also observed in Camellia sasanqua Thunb. It is difficult to observe "flashing" in pollen of Cedrus deodara Loud.. "Flashing" was observed in dead pollen of rye (Secale cereale L.) and it was flashed twice but did not occur pseudoplasmolysis. Typical extracellularfreezing was observed in pollen of Larix leptolepis Gordon. Mounted water formed ice-crystal when ice nucleus was inoculated at --5℃ and prothalial cell in larch pollen shrinked as time prolong (photo. 8). Pollen viability was not seriously affected by extracellularfreezing and the shape of pollen was changed when it was rewarmed.